产品货号:
ALH266
中文名称:
反转录试剂盒(去除gDNA)
英文名称:
LabScript RT Kit
产品规格:
50T|100T
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本试剂盒是一种高效、稳定、快速并可以去除基因组DNA污染的反转录系统。试剂盒采用分子进化技术多点突变的新一代反转录酶LabScript M-MuLV RTase,大幅度提高了稳定性和反转录效率。
本试剂盒为一管式反转录预混反应液,5×RT MasterMix II中含有反转录第一链合所需的所有试剂(LabScript M-MuLV RTase、RNase Inhibitor、Random primers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、Buffer)。
通常Real-Time RT-PCR等实验需要先用DNase I消化去除RNA中残留的基因组DNA(gDNA),但是传统DNase I处理复杂并容易造成RNA的降解和损失。本试剂盒中使用了具有DNA分解活性的特殊4×gDNA Eraser Mix,2分钟消除gDNA残留,不需要DNase消化和后续繁琐步骤。
- 第一链cDNA合成。
- 可用于高拷贝、低拷贝基因的检测。
- 新一代反转录酶LabScript M-MuLV RTase大幅度提高了稳定性和反转录效率。
- 采用gDNA Eraser仅需2分钟清除DNA残留,不需要DNase消化和后续繁琐步骤。
- 全预混的反转录Mix,只需加入RNA和水,15分钟简单快速完成反转录。
- 同时2种Mix在-20℃不易冻结,减少了化冻和混匀时间,使用更简单。
- 本制品针对qPCR进行特别优化oligo dT和N6随机引物配比,使cDNA合成可从RNA转录本的各个区域起始并具有相同的反转录效率,最大程度保证了qPCR结果的真实性和可重复性。
组分 | 50次 | 100次 |
4×gDNA Eraser Mix | 200μL | 400μL |
5×RT MasterMix II | 200μL | 400μL |
5×No RTase Control Mix | 20μL | 40μL |
RNase-free H2O | 1mL | 1mL |
保存:-20℃,有效期1年。
- 实验过程中应特别注意避免RNase污染。
- 为保证反转录成功建议使用高质量的RNA样品。
- 5×No RTase Control Mix除了不含LabScript M-MuLV反转录酶,其他成分和5×RT MasterMix II完全一致,可以用于反转录的阴性对照。
- 4×gDNA Eraser Mix、5×RT MasterMix II非常粘稠,溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失,用前请点甩离心后使用,并且避免吸头外壁沾附损失。4×gDNA Eraser Mix和5×RT MasterMix II内包含的酶均为过量,即使每次按照3.6μL~3.8μL使用,也不影响使用效果。
- 可以不经过基因组去除步骤,直接用5×RT MasterMix II进行反转录,这样所得到的结果会与使用5×RT MasterMix(货号:ALH264)相当。
以20μL反应体系为例,也可以采用10μL反应体系
- 将模板RNA在冰上解冻;4×gDNA Eraser Mix和RNase free H2O在室温(15~25℃)解冻,解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液轻弹或者轻微涡旋振荡混匀,简短离心以收集残留在管壁的液体到管底。
- 在RNAse free管里面加入以下成分:(建议使用PCR管冰上配制)
注*:Total RNA不超过2μg,mRNA不超过200ng (20μL体系)成分 用量 Total RNA/mRNA ≤ 12μL* 4×gDNA Eraser Mix 4μL (见注意事项3) RNase-free H2O 至16μL - 移液器轻轻吹打混匀,42℃孵育2分钟(或者37℃孵育5分钟)。控温步骤均建议PCR仪器上进行。
- 继续直接在同一管加入如下成份:
成分 用量 5×RT MasterMix II ≤ 4μL (见注意事项3) - 移液器轻轻吹打混匀(总体积20μL)
如使用mRNA模板是来源于真核细胞(如人、小鼠的组织细胞)含有Poly(A)尾结构,42℃孵育15~20min。如使用mRNA模板是来源于原核细胞(细菌)或者病毒等不含Poly(A)尾结构,25℃孵育10min,42℃孵育15~20min。
注意:如果模板具有复杂二级结构或高GC区域,可尝试将反应温度提高至50℃,有助于提高产量。 - 85℃加热5min失活LabScript M-MuLV RTase和gDNA Eraser。
- 得到的cDNA产物可立即用于qPCR反应,或在-20℃保存,并在半年内使用;长期存放建议分装后在-70℃保存。cDNA应避免反复冻融。
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